Western Blot的技巧和窍门

        如果您需要从样本中鉴定特定的氨基酸序列，Western Blotting是您应该选择的技术。
靶蛋白通过使用精心选择的一抗和二抗进行标记，从而实现对感兴趣的特异蛋白的可视化。与其他实验室技术一样，Western Blotting需要在每个阶段进行精确的设计，以获得最佳结果。       
         凭借多年的经验，我们biorbyt已经掌握了最优的方法。我们旨在为您提供最专业的采购建议和技术指导，使您更轻松、更高效、更准确地完成结果优化。
        通过Western blot，您可以通过提高信噪比来获得最清晰的结果，清楚地显示特异条带并最小化非特定条带的存在。有很多步骤可以实现这一目标。

Western blotting方案概括如下：
１.使用细胞裂解液提取蛋白质
２.使用电泳根据大小/重量分离蛋白质分子
３.将蛋白质分子转移到固体膜上
4.一抗，二抗孵育，通过标记物实现目标蛋白可视化
5.洗去未结合的抗体
6.检测到感兴趣的目的蛋白质

 抗体选择
1.根据目的蛋白选择已经过Western blot检测验证的一抗。
２．选择正确的检测二抗。
３.Biorbyt可以为您的抗体选择提供专业的意见和咨询服务。
4.摸索最佳的抗体浓度。抗体浓度，pH值和温度是影响抗原抗体结合的重要因素。您可以通过改变抗体稀释度摸索一系列抗体浓度而找到最佳的抗体反应浓度。Biorbyt建议每次更改条件时都要进行抗体最适浓度摸索实验。我们的产品说明书会提供稀释范围作为指导，我们建议您从稀释范围中间值的浓度开始进行预实验，根据预实验结果进行上调或下调。

5.在某些情况下，我们还会建议进行二抗浓度摸索。如用于化学发光检测的HRP标记的二抗，不同的二抗浓度会产生不同的结果，因此为了获得清晰准确的结果，二抗浓度摸索也是值得的。

蛋白提取小提示：
１．组织或细胞提取蛋白时低温操作（4℃）。
２． 组织/细胞离心收集后，加入裂解液和蛋白酶抑制剂。必要时选择加入不同浓度的蛋白酶抑制剂，以获得足够高浓度的蛋白样本。

样本准备
１.使用Bradford, Lowry或者BCA方法进行蛋白浓度测定，确保上样量一致。
２.每个上样孔建议20~40ug的总蛋白上样量。
3.每个上样孔添加适当比例的上样buffer。
4.每个泳道的上样体积等于总上样体积。

凝胶准备
１.良好的凝胶质量有助于转膜成功。
２.请参阅我们网站上的实验方案指南，选择合适的凝胶配方比例。
３.准备插入浓缩胶溶液的梳子。Biorbyt建议您使用移液管缓慢添加凝胶。
４.10% AP和TEMED会促进胶凝固，因此建议在配胶最后加入。
5.利用毛细管作用，用吸水纸去除多余的水分。
6.可以将一些凝胶保存在试管中以检查其凝固状态。

电泳
1.一旦您的缓冲液在电泳仪中并覆盖凝胶，请连接电源，连接器：红色接头连接红色接头，黑色接头连接黑色接头。
2.小心取出梳子后，将样品和蛋白marker加入到凝胶中。
3.确保电源组选择了匹配正在使用凝胶的正确电压。

电转移
１.最常用的膜是PVDF（聚偏二氟乙烯）和NC（硝化纤维素），都有一系列不同的规格，您的选择会影响您的结果。PVDF和NC膜都有不同的孔径，您可以根据所分离的目的蛋白的大小进行选择。
２.Biorbyt可以指导您选择合适的膜，以确定最佳的实验方案而获得最佳的实验结果。
３.如果您的目的是洗去一抗并重新探测印迹，则PVDF膜是更好的选择。因为PVDF膜具有更好的耐腐蚀性和稳定性，可以更好保留蛋白质。NC膜更易于封闭非特异性结合，背景低，会提供很好的信噪比。
４.当将甲醇浸泡过的PVDF膜置于凝胶中时，确保没有多余的液体并且没有气泡。
５.将转膜装置放置于冰上，保持4°C的温度。
６.膜应该位于凝胶和正极之间。
７.根据凝胶的浓度，厚度选择最佳的电泳时间。

 封闭
１.封闭液的选择有很多种，每种缓冲液适应不同的工作条件，建议选择最适合您抗体抗原的封闭液。
２.牛奶封闭液含有内源性生物素，糖蛋白和酶，这些化学物质有时会影响你的信号。
３.膜封闭建议处理一个小时。
４.Biorbyt的封闭液对特定条件进行优化，我们将很乐意给您提供相关建议。

 抗体孵育
１.我们建议用5% BSA稀释一抗，摇床4℃孵育12小时。

 二抗
１.参考实验方案，建议二抗37℃孵育1小时。

２.二抗孵育结束后，重复洗涤步骤。然后用ECL发光液进行曝光。

 洗涤
１.洗涤全程在摇床上，用TBST洗涤最少需要三次，每次最少5分钟。
２.更多洗涤调节选项：根据具体情况改变洗涤时间或液体体积，改变洗涤剂强度。
３.稍微增加洗涤液Tween-20的浓度，是洗去高背景的一种好办法。

 可视化观察
１.我们建议您尝试不同的曝光时间而最终获得最清晰的结果，过长的曝光时间会导致高背景或者条带过曝。
２.与Western Blotting的所有其他步骤一样，曝光条件也有多种选择。您可以微调您的实验设计，以提高结果的准确性和清晰度。Biorbyt提供相关化学发光试剂和替代品，可以给你您提供最完美的选择。如果您需要更持久的信号以获得更高的重现性，我们也可以提供更灵敏的试剂。
３.我们建议选择专为化学发光检测而设计的胶片和选择不同的曝光时间，以获得最佳的结果图。
４.Biorbyt团队致力于支持您的研究。使用我们的专业知识和经验来帮助你获取更准确，更强大，更可靠的结果。