重组质粒引物设计总原则

引物设计总的原则

1.引物长度

一般引物长度为 18~30 碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm 值）最重要的因素就是引物的长度。各引物设计软件均可计算引物的退火温度，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化 PCR 反应，使用确保退火温度不低于 54℃ 的最短的引物可获得最好的效率和特异性。

2.含量引物序列中

含量一般为 40%~60%,一对引物的 GC 含量和 Tm 值应该协调。若是引物存在严重的 GC 倾向或 AT 倾向则可以在引物 5’端加适量的 A、T 或 G、C 尾巴。

3.退火温度

退火温度需要比解链温度低 5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使 PCR 的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是 DNA 双链结合。一对引物的退火温度相差 4℃~6℃ 不会影响 PCR 的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在 55℃~75℃ 间变化。

4.避免扩增模板的二级结构区域

选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G）小于 58.6lkJ/mol 时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用 7-deaza-2’-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。

5.与靶 DNA 的错配

当被扩增的靶 DNA 序列较大的时候，一个引物就有可能与靶 DNA 的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用 BLAST 软件进行检测，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。选择引物末端引物’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3’端不应超过 3 个连续的 G 或 C,因这样会使引物在 G+C 富集序列区错误引发。3’端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的 PCR（AS-PCR）反应中，引物 3’端不能发生错配。如扩增编码区域，引物 3’端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

6.引物的二级结构

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于 3bp.两引物之间不应该存在互补性，尤应避免 3’端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于 4 个连续碱基的同源性或互补性。H 为了下一步操作而产生的不完全匹配 5’端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的「牺牲」。

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