免疫组化、Western都是免疫学三大工具之一。

         免疫组化：融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原(多肽和蛋白质)进行定位、定性及相对定量的研究(主要是定位)。样本是细胞或组织，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。

         免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。


免疫组化结果常见问题分析

(一) 结果阴性的原因

1. 抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误； 

2. 抗原修复不全，换修复液或加强修复；

3. 组织切片本身这种抗原含量低，设阳性对照片；

4. 血清封闭时间过长；DAB 孵育时间过短；

6. 细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。


(二)非特异性染色的原因（着色一片黄/背景深）

1. 抗体孵育时间过长，抗体浓度；

2. 多抗易出现非特异性，可选择单抗；

3. 内源性过氧化物酶和生物素灭活不够；

4. 非特异性组分与抗体结合，延长血清封闭时间；

5. DAB 孵育时间过长或浓度过高；

6. PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；

7. 标本染色过程中经常出现干片；

8. 脱蜡不充分；

9. 二抗与标本的内源性组织蛋白有交叉反应。


（三）染色弱阳性

1. 固定方式不当或固定时温度过高，影响到抗原的数量和质量；

2. 不适当的抗原修复方式，抗原决定簇暴露不足；

3. 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间不足；

4. 孵育抗体前切片上遗留了过多的冲洗液；

5. 孵育时切片未放置水平，导致抗体孵育不均匀。

（四）信号定位与预测不符的原因

1. 组织固定不及时，抗原扩散移位；

2. 抗体选择错误；

3. 膜蛋白核质染色：抗原修复过长，导致细胞膜破坏，膜蛋白转移。

 

WB 结果常见问题分析

一． 高背景
1. 原因：封闭不好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够；
2. 优化：增加封闭时间，降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数；
3. 解析：高背景是 WB 中最常见出现的问题，如果目的条带单一清晰，其他地方出现均一的背景，可以提高吐温比例，洗膜 5 min*5 次或者 10 min*3 次，不要图快肆意改时间和次数；如果出现非均一性背景，实验过程中要保持膜不被干；严格按照实验操作 SOP，养成好的实验习惯。

二. 空白片
1. 原因：比较多，最可能是一抗加错了，或者稀释时没取到亦或原管抗体没有混匀，再有可能二抗种属加错了，例如常见是兔的加成鼠的；转膜电压电流时间等；
2. 优化：仔细检查抗体是否加错，核实转膜设置没有问题；
3. 解析：胶片上一点信号都没有，多数情况是抗体加错了；如果中间出现了微弱的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL 发光液稀释过高或失效。若转膜出现了失误，比如膜放反了，肯定白片。

三． 非特异性条带
1. 原因：一抗有非特异性与蛋白结合；
2. 优化：更换一抗或参考「高背景」；
3. 解析：此种情况多数是因一抗不好，换一支抗体；设置好对照组区分目的条带；还有可能是一抗浓度过高引起的非特异性结合。

四． 条带有边缘规则的白圈
1. 原因：转膜时膜和胶之间存在气泡；
2. 优化：转膜前去掉膜和胶之间的气泡；
3. 解析：赶气泡太容易，省略。

五. 条带中间出现白斑点
1. 原因：底物消耗过快，中间区底物消耗完不发光了；
2. 优化：降低蛋白量，降低一抗和二抗的浓度；
3. 解析：快速操作，在中间部位底物消耗之前就把胶光片定影出来，一般实验员很难把控制；优先从降低蛋白量，降低一抗二抗浓度入手。

六. 出现黑点
1. 原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合；
2. 优化：封闭用的牛奶一定要纯并且完全溶解，封闭后至少洗膜一次；
3. 解析：确定封闭牛奶完全溶解，否则封闭时会导致不溶性颗粒附着在膜上，在发光时膜上会出现黑点；建议在牛奶溶解之后静止三分钟，轻取上层牛奶液进行封闭，封闭结束常规洗膜一次；孵育一抗或二抗时，需要加牛奶的也请参照此操作。

七. 条带拖尾
1. 原因：蛋白量太大，一抗浓度偏高和孵育时间太长；
2. 优化：根据实验需求调整上样蛋白量，调整一抗浓度和时间；
3. 解析：这种情况也是常见问题，上样蛋白量一般会做预实验避免；还有容易发生的是一抗浓度太高，作用时间太长引起的，品牌一抗都有稀释比例建议；再个质量好的一抗直接 37 度孵育半小时就好，无需孵育过夜；再强调一遍洗膜千万不要偷懒，次数和时间洗到位，不要担心把抗体和蛋白洗掉没那么脆弱。

八. 条带变形或奇型
1. 原因：配置胶有问题，胶中存在气泡或者某不溶性颗粒，电泳电流不均一；
2. 优化：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。
3. 解析：多数实验室使用设备都有些年限，比如配胶用的海绵垫或塑胶条等，用久了不密封出现漏液漏气；各 buffer 要注意不要有杂质；不使用边缘效应孔上样。

九. 其他问题

1. 条带连成一片。多数原因是上样量过多，其次是样品弥散或中途停止了电泳；

2. 条带偏高或者偏低。常有可能是蛋白有修饰现象；还有可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，例如说 100KD 以上的蛋白用的 12% 胶跑，或者说 20KD 的蛋白用的 6% 胶跑；再是蛋白有降解，会在比原来位置低的地方出现主带，跟着出现一些其他条带，明显现象是所有的条带比正常的都低，且条带模糊不清晰。

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