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宠客户：IHC，WB 常见问题与结果解析

发布时间：2020-11-10 11:05 点击次数：

免疫组化结果常见问题分析

2. 抗原修复不全，换修复液或加强修复；

3. 组织切片本身这种抗原含量低，设阳性对照片；

4. 血清封闭时间过长；DAB 孵育时间过短；

6. 细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。


(二)非特异性染色的原因（着色一片黄/背景深）

1. 抗体孵育时间过长，抗体浓度；

2. 多抗易出现非特异性，可选择单抗；

3. 内源性过氧化物酶和生物素灭活不够；

4. 非特异性组分与抗体结合，延长血清封闭时间；

5. DAB 孵育时间过长或浓度过高；

6. PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；

7. 标本染色过程中经常出现干片；

8. 脱蜡不充分；

9. 二抗与标本的内源性组织蛋白有交叉反应。


（三）染色弱阳性

1. 固定方式不当或固定时温度过高，影响到抗原的数量和质量；

2. 不适当的抗原修复方式，抗原决定簇暴露不足；

3. 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间不足；

4. 孵育抗体前切片上遗留了过多的冲洗液；

5. 孵育时切片未放置水平，导致抗体孵育不均匀。

1. 组织固定不及时，抗原扩散移位；

2. 抗体选择错误；

3. 膜蛋白核质染色：抗原修复过长，导致细胞膜破坏，膜蛋白转移。

WB 结果常见问题分析

1. 无条带：抗体用错，转膜出错，抗原无表达，试剂失效等；

2. 细微弱带：上样量少，抗体浓度低，ECL 发光液失效等；

3. 高背景：封闭不够，一抗浓度高，洗膜不充分；

4. 非特异性条带：抗体特异性差，也可能样品量大，抗体浓度高；

5. 条带出现边缘规则的白圈：转膜时膜和胶之间有气泡；

6. 条带中间出现白色：高浓度 HRP 把底物消耗过快后不发光；

7. 膜上很多黑点：膜上杂质与抗体非特异结合，洗膜充分，封闭液混匀；

8. 条带拖尾：蛋白裂解不好，蛋白量大，抗体孵育时间长，浓度高等；

9. 出现非均一性背景：洗抗体和发光时膜出现风干情况；

10. 条带弯曲不平整：胶配置不均匀，胶中有气泡杂质，玻璃板没洗干净，电流不均一等；

11. 条带蛋白分子量偏高/偏低：分离胶浓度选择不恰当，蛋白质降解；

12. 所有条带练成片：上样量大或电泳中途停止过长，样品弥散。



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