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宠客户:IHC,WB 常见问题与结果解析

发布时间:2020-11-10 11:05 点击次数:

免疫组化结果常见问题分析


(一) 结果阴性的原因

1. 抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误; 

2. 抗原修复不全,换修复液或加强修复;

3. 组织切片本身这种抗原含量低,设阳性对照片;

4. 血清封闭时间过长;DAB 孵育时间过短;

6. 细胞通透不全,抗体未能充分进入胞内参与反应。


(二)非特异性染色的原因(着色一片黄/背景深)

1. 抗体孵育时间过长,抗体浓度;

2. 多抗易出现非特异性,可选择单抗;

3. 内源性过氧化物酶和生物素灭活不够;

4. 非特异性组分与抗体结合,延长血清封闭时间;

5. DAB 孵育时间过长或浓度过高;

6. PBS 冲洗不充分,残留抗体结果增强着色;

7. 标本染色过程中经常出现干片;

8. 脱蜡不充分;

9. 二抗与标本的内源性组织蛋白有交叉反应。


(三)染色弱阳性

1. 固定方式不当或固定时温度过高,影响到抗原的数量和质量;

2. 不适当的抗原修复方式,抗原决定簇暴露不足;

3. 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间不足;

4. 孵育抗体前切片上遗留了过多的冲洗液;

5. 孵育时切片未放置水平,导致抗体孵育不均匀。


(四)信号定位与预测不符的原因

1. 组织固定不及时,抗原扩散移位;

2. 抗体选择错误;

3. 膜蛋白核质染色:抗原修复过长,导致细胞膜破坏,膜蛋白转移。




 

WB 结果常见问题分析

1. 无条带:抗体用错,转膜出错,抗原无表达,试剂失效等;

2. 细微弱带:上样量少,抗体浓度低,ECL 发光液失效等;

3. 高背景:封闭不够,一抗浓度高,洗膜不充分;

4. 非特异性条带:抗体特异性差,也可能样品量大,抗体浓度高;

5. 条带出现边缘规则的白圈:转膜时膜和胶之间有气泡;

6. 条带中间出现白色:高浓度 HRP 把底物消耗过快后不发光;

7. 膜上很多黑点:膜上杂质与抗体非特异结合,洗膜充分,封闭液混匀;

8. 条带拖尾:蛋白裂解不好,蛋白量大,抗体孵育时间长,浓度高等;

9. 出现非均一性背景:洗抗体和发光时膜出现风干情况;

10. 条带弯曲不平整:胶配置不均匀,胶中有气泡杂质,玻璃板没洗干净,电流不均一等;

11. 条带蛋白分子量偏高/偏低:分离胶浓度选择不恰当,蛋白质降解;

12. 所有条带练成片:上样量大或电泳中途停止过长,样品弥散。



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