胆管癌（CCA）是胆道上皮细胞的恶性转化。它是一种生长缓慢的肿瘤，但它也是高度转移的，预后不良。这种癌症的发病率在亚洲最高，特别是在泰国东北部。在大多数CCA病例中，病因尚不清楚。胆管内的慢性炎症和细胞损伤，以及胆汁流动的部分阻塞导致CCA发展的高风险条件。肿瘤不仅可以发展出在胆汁的有毒环境中生存的机制，还可以利用胆汁成分来促进细胞生长，存活和侵袭。已知胆汁酸会反活化胆管细胞中的表皮生长因子受体（EGFR）并诱导环加氧酶-2（COX-2）表达。这些后果有助于促进血管生成并促进各种癌症类型的细胞生长。此外，胆汁酸可增强CCA细胞中有效的抗凋亡蛋白髓细胞白血病蛋白1（Mcl-1）的水平。
         慢性炎症期间胆汁组成的改变可能对胆道肿瘤的癌变和进展很重要。脱氧胆酸（DCA）通过诱导EGFR活化发挥促癌作用，这反过来又导致刺激有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号级联反应，并伴有细胞外信号调节激酶1/2，p38和c-Jun N-末端激酶蛋白。已知牛磺胆酸（TCA）刺激某些细胞因子的分泌，包括单核细胞化学吸引蛋白-1（MCP-1）和白细胞介素-6（IL-6），胆管细胞参与胆汁淤积性疾病期间发生的炎症和纤维化过程。此外，鹅去氧胆酸（CDCA）和石胆酸（LCA）可以通过刺激蜗牛信号通路促进CCA侵袭性，从而导致E-钙粘蛋白的下调。
         本研究旨在研究胆汁酸对人类CCA细胞迁移的影响。为了阐明胆汁酸诱导细胞迁移的潜在机制，使用蛋白质组学方法研究了胆汁酸处理的CCA细胞的蛋白质表达谱。

 

结果

CA(胆酸)和DCA(脱氧胆酸)处理增强CCA细胞迁移

使用伤口愈合测定法，将KKU-M213细胞的迁移与MMNK-1细胞的迁移进行比较。在没有胆汁酸刺激的情况下，KKU-M213和MMNK-1细胞在12 h和24 h的迁移程度彼此之间没有显着差异（表一).在用各种胆汁酸处理KU-M213和MMNK-1细胞后，使用伤口愈合测定法评估细胞运动。CA和DCA均被证明可以增强细胞迁移，与MMNK-1细胞相比，在12（P=0.021和0.002）和24小时（P=0.001和0.001）时，KKU-M213细胞的疗效明显更高（表一).其他四种类型的胆汁酸在孵育24小时后没有显着诱导细胞迁移。

表一.胆汁酸对伤口愈合试验中KKU-M213和MMNK-1细胞迁移的影响。

用每种胆汁酸类型的100μM处理细胞。

一个迁移百分比 = [0–12 小时（或 24 小时）处的边缘距离/0 小时时的边缘距离] ×100。

bKKU-M213和MMNK-1细胞之间迁移百分比的差异。使用Mann-Whitney U检验来确定组之间的显着差异。<，迁移速度较慢; >，迁移速度更快; CA，胆酸; DCA，脱氧胆酸; TCA，牛磺胆酸; TDCA，牛磺脱氧胆酸; GCA，糖胆酸; GDCA，糖脱氧胆酸。

 

胆汁酸对CCA细胞蛋白表达的影响

为了评估CA-或DCA诱导的细胞迁移增强是否与蛋白质表达的变化有关，使用2-DE评估蛋白质表达谱。将2D图像中KKU-M213细胞的蛋白质谱与CA-（图 1）和DCA治疗的疾病（未提供数据）。在比较之前，通过每个未处理的条件减去所有斑点，以选择用于匹配斑点分析的候选斑点。
 

图一

与（B）CA处理的MMNK-1细胞相比，（A）CA处理的KKU-M213细胞的蛋白质斑点的二维电泳模式。x 轴表示等电点值，y 轴表示分子量 （kDa）。CA，胆酸。在对CA处理组进行点匹配分析后，与MMNK-1细胞相比，KKU-M213细胞中发现19个蛋白质斑点过表达，19个蛋白质斑点表达不足。此外，仅在KKU-M213细胞中观察到77个蛋白质斑点。在DCA处理的组中，与MMNK-1细胞相比，KKU-M213细胞中鉴定出31个蛋白质斑点过表达，37个蛋白质斑点表达不足。此外，仅在KKU-M213细胞中检测到50个蛋白质斑点。切除仅在KKU-M213细胞中表达的蛋白质斑点，或那些在三份凝胶中MMNK-1细胞中同一斑点中表现出≥2倍的密度差异的蛋白质斑点（CA-处理条件下为14个斑点，DCA处理条件下为13个斑点），并进行凝胶内消化以进行进一步的MS分析。经MS分析，只有1/27个斑点的蛋白评分为>56（命中率差异显着不同，P<0.05），即斑点M97中的CCDC25。如上所示图 2，该斑点在用CA（图 1).所有其他斑点的蛋白质评分均为<56。采用蛋白质印迹分析检查了从3名患者获得的CCA和邻近非癌组织样品的组织裂解物中CCDC25的表达水平。在CCA组织中观察到CCDC25蛋白的高表达，但在邻近的非癌组织中却没有观察到（图 2).

 

图 2.CCDC25蛋白在CCA和邻近非癌组织样品中的表达水平。

（A）使用蛋白质印迹分析检测组织裂解物中的CCDC25蛋白。在CCA（Ca1-3）组织中观察到高表达水平的CCDC25，但在相邻（Adj1-3）非癌组织样品中未观察到。（B）β肌动蛋白作为对照。y 轴表示分子量 （kDa）。CCA，胆管癌;CCDC25，coiled-coil domain containing 25.

 

蛋白质谱鉴定两种推定的迁移相关 EFFR

使用STITCH软件（版本3.1）预测了推定的迁移相关蛋白的关联或相互作用，包括EGF，EGFR，生长因子受体结合蛋白2（GRB2），CCDC25，七无同源物1（SOS1）的子和含有转化蛋白1的Src同源性2结构域。CCDC25被确定与SOS1和GRB2相关。预测这两种蛋白质与EGFR信号传导相关。因此，CCDC25可能是参与癌细胞迁移（图 3).
 

 

讨论

       目前的结果表明，CA和DCA增强了CCA细胞（KKU-M213）的迁移，而不是对照（MMNK-1）细胞的迁移。胆汁酸刺激癌症进展需要许多信号通路，包括磷酸肌醇-3-激酶，蛋白激酶C，MAPK和COX-2。Pai等人（ Pai R, Tarnawski AS, Tran T. Deoxycholic acid activates beta-catenin signaling pathway and increases colon cell cancer growth and invasiveness. Mol Biol Cell. 2004;15:2156–2163. doi: 10.1091/mbc.E03-12-0894. ）报道DCA激活了β-连环蛋白信号通路，这增加了结肠癌细胞的生长和侵袭。Debruyne等人（Debruyne PR, Bruyneel EA, Karaguni IM, Li X, Flatau G, Müller O, Zimber A, Gespach C, Mareel MM. Bile acids stimulate invasion and haptotaxis in human colorectal cancer cells through activation of multiple oncogenic signaling pathways. Oncogene. 2002;21:6740–6750. doi: 10.1038/sj.onc.1205729.）证明，胆汁酸能够通过激活多种致癌信号通路来刺激人类结直肠癌细胞的侵袭和拮抗性。浓度为100μM的未结合CDCA和LCA可能激活蜗牛基因的转录，其下调E-钙粘蛋白的表达，从而促进人肝细胞癌细胞的侵袭。这些结果表明，胆汁酸对癌细胞的刺激作用是可变的，这取决于各种形式的胆汁酸和癌细胞的组合。
 

        在本研究中，观察到CA和DCA改变CCA细胞和胆管细胞的蛋白质表达模式。CA和DCA是非共轭形式;与共轭亲水胆汁酸相比，未结合的疏水性胆汁酸对核受体（例如法呢类X受体）具有更高的亲和力，因此可能对癌症进展有影响。据推测，未结合的胆汁酸可以通过质膜的被动扩散进入细胞，可以直接激活核受体并调节蜗牛启动子上刺激蛋白1（Sp1）的转录活性。某些报告表明，未结合的胆汁酸可能诱导细胞凋亡，特别是在高浓度（>100μM）下。
 

       本研究采用蛋白质组学方法显示，与MMNK-1细胞相比，CA和DCA上调KKU-M213细胞的蛋白表达更多。在CA刺激的KKU-M213细胞中上调蛋白中，与对照组MMNK-1细胞相比，只有CCDC25在KKU-M213细胞中的表达显着更高。当使用蛋白质印迹分析检查CCA组织和邻近非癌性组织样品中的CCDC25蛋白表达时，CCDC25在CCA中高度表达，但在所有三个样品的相邻非癌组织中均未高度表达。CCDC25的功能仍然知之甚少。此前，据报道，8p染色体上包括CCDC25在内的六个基因簇的缺失被发现与肝细胞癌患者的预后不良有关。
 

       在本研究中，将鉴定出的感兴趣的蛋白质和生物分子提交给STITCH数据库，以研究潜在的细胞功能，并确定细胞中蛋白质之间的相关功能相互作用。结果显示CCDC25和SOS1或GRB2之间存在很强的相互作用，它们也与EGFR信号传导高度相关。先前的研究表明，200μM的DCA通过激活EGFR诱导COX-2蛋白表达，并且还可以通过激活人CCA细胞系中的EGFR / RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸 - 蛋白激酶信号传导级联反应来抑制其降解来增加细胞Mcl-1蛋白表达。有必要进一步研究非偶联胆汁酸上调CCD25表达的分子机制以及CCDC25，SOS1和GRB2之间的相互作用。综上所述，本研究结果表明，CA可以作为细胞迁移的刺激剂，并且可以提高CCD25在人CCA细胞系中的表达水平。该分子被假设通过EGFR信号通路参与细胞迁移。这种蛋白质的抑制可能是未来治疗CCA患者的替代治疗选择。

 

为了验证CCDC25蛋白的表达，使用蛋白质印迹分析过程中，用到抗人CCDC25抗体（cat no.orb2517;Biorbyt Ltd.，Cambridge，UK），检查三个配对的癌性和相邻非癌性组织样品。

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 文献来源：1.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5529998/


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