当病原微生物侵入机体时会诱导机体体液免疫产生相应的抗体。病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。
 

 

        中和试验（Neutralization，NeA），是根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验。以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清（中和抗体）中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清（中和抗体）中和病毒的能力。

中和抗体的作用机制：

1.直接封闭病毒表面抗原，与病毒表面吸附蛋白结合，从而阻断病毒的吸附

2.改变病毒表面结构

3.病毒与中和抗体形成的免疫复合物，易被巨噬细胞吞噬清除

4.有包膜的病毒表面抗原与中和抗体结合后，激活补体，可导致病毒的裂解

 

         中和试验既能定性又能定量，主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、病毒抗原性的分析、疫苗免疫原性的评价、血清抗体效价的检测等。

这里需要先介绍下“病毒毒力的单位”：由于剂量的递增与死亡率的递增的关系不是一条直线，而是呈S形曲线，在越接近100%死亡时，对剂量的递增越不敏感。而死亡率愈接近50%时，剂量与死亡率呈直线关系，所以现在基本上采用半数致死量（LD50）作为毒力单位。 以感染发病作为指标的，可用半数感染量（ID50）。鸡胚半数致死量（ELB50），鸡胚半数感染量(EID50)；组织细胞半数感染量（TCID50）。在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量（IMD50）和半数保护量(PD50)。

 

        中和试验可在体内（易感的实验动物体内）也可在体外（细胞培养或鸡胚）进行。

        体内中和试验，对试验动物接种疫苗或抗血清，间隔一定时间后，再用一定量的病毒攻击，最后根据动物是否得到保护来判定结果。常用于疫苗的免疫原性的评价和抗血清的质量评价。

 

       体外中和试验是将抗血清与病毒混合，在适当条件下作用一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，以检测混合液中病毒的感染力。根据保护效果的差异，判断该病毒是否已被中和，并可计算中和指数，即中和抗体的效价。根据测定方法的不同，中和试验分简单定性中和试验、终点法和空斑减数法。

 

简单定性中和试验

        主要用于检出病料中的病毒，亦可进行初步鉴定或定性。先根据病毒的易感性选定试验动物（或鸡胚、细胞培养）及接种途径。将病料研磨并稀释成一定浓度（约100LD50-1000LD50或TCID50）。污染的病料需加抗生素（青霉素、链霉素各200-1000单位），或用细菌滤器过滤，与已知的抗血清等量混合，正常血清加稀释病料作对照。混合后置37℃ 1h，分别接种试验动物，每组至少3只，分别隔离饲喂，观察发病和死亡情况。若对照动物死亡，而中和组动物不死，则证实该病料中含有与该抗血清相应的病毒。本法也可用于毒素（如肉毒毒素）的鉴定和分型。

 

终点法中和试验（Endpoint neutralization test）

        是滴定使病毒感染力减少至50%时，血清的中和效价或中和指数。有2种方法：固定血清稀释病毒法和固定病毒稀释血清法。

        固定血清稀释病毒法：将病毒原液作10倍递增稀释，分装两列无菌试管，第一列加等量正常血清（作为对照组），第二列加等量待检血清（试验组），混合后置37℃作用1h，每一稀释度接种3-6只试验动物（或鸡胚、组织细胞），记录每组动物死亡数、累计死亡数和累计存活数，按Karber法计算LD50 。最后计算中和指数。中和指数=试验组LD50 /对照组LD50

Karber法，公式为lgTCID50=L+d（S-0.5），

L:病毒最低稀释度的对数；

d：稀释系数，10倍递进稀释是d=-1；

s：死亡比值之和，即各组死亡（感染）数/试验数相加。

      固定病毒稀释血清法：将已知的病毒量固定，血清作倍比稀释，常用于测定抗血清的中和效价。

 

空斑减数法中和试验（Plague reduction test）:

        空斑是指把病毒接种于单层细胞，经过一段时间培养，进行染色，原先感染病毒的细胞及病毒扩散的周围细胞会形成一个近似圆形的斑点，类似固体培养基上的菌落形态。空斑减数法中和试验，多在细胞培养上进行的。先将病毒稀释成适当浓度，使每0.2ml含80-100个PFU,与不同稀释度的待检血清等量混合，置37℃作用1-2h，分别测定PFU。使空斑数减少50%血清稀释度即为该血清的中和价。

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