Western Blot（蛋白印迹）实验既可以用于定性分析蛋白表达产物表观大小和定位，也可以定量分析组织中特定蛋白的表达量，鉴定基因表达水平的变化。严谨的 Western Blot实验设计中要求具有良好的参照体系——内参，这对结果分析是非常有用的。

内参即是内部参照 (Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白 (Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

 

内参检测的必要性

在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白上样量、判断转膜效率、排除上样过程中存在的实验误差等，保证实验结果的准确性。

1.校正蛋白上样量

在WB实验中，比较不同样本中某种蛋白的表达量时，如果上样量有差异，无疑会严重影响实验结论。检测内参并确保各泳道间内参蛋白量一致即可排除上样量的影响。

2.判断转膜效率

除了上样量，转膜时不同泳道之间的转移效率不同，也会给最终结果带来极大影响。在比较不同泳道样品中目标蛋白表达量时，可以根据内参蛋白的转印效率来确定目的蛋白是否被有效转印到膜上。

3.排除边界效应

如果一次WB检测样本较多而使用较大的凝胶，凝胶边缘泳道在转膜时效率可能与中间的泳道效率不同。内参的设置同样可以排除边界效应的影响。

4.检测显色或发光体系是否正常

由于内参蛋白在样本中通常是高表达，比较容易被检测到，因此也可作为其中一种WB实验的阳性对照。通过内参的信号，来判定显色或发光体系是否正常工作。

 

内参的选择

选择一个合适的内参蛋白，应考虑样本种属、靶标蛋白的亚细胞分布、内参蛋白分子量（区别于目标蛋白）、样本的类型，甚至实验处理类型等。

1.根据不同的种属，哺乳动物的样本需要选择哺乳动物中稳定表达的蛋白作为内参；植物样本需要选择植物中稳定表达的蛋白做内参；

2.靶标蛋白的细胞定位不同，适合的内参也不同。如全细胞裂解液可选择beta-actin、beta-tubulin 等，膜蛋白一般选择细胞膜上的钠钾离子泵蛋白（Na/K ATPase）作为参照蛋白，核蛋白则选择 Lamin B、Histone H3 等；

3.根据蛋白大小选择，一般要选择目的蛋白与内参分子量相差至少5kD以上，才便于对结果分析。

4.根据实验的具体条件选择，有些实验条件会对管家基因的表达有影响而导致部分管家基因不适合做改条件下的内参基因，比如于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参；凋亡实验时，Lamin等也不适合作为内参。

5.根据样本类型选择内参，比如做各种分泌液样本的时候，如血浆、乳汁、组织液等，由于没有完整的细胞结构，只能选择一些分泌蛋白作为内参。

 

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