流式细胞术是一种在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术，其在细胞生物学、细胞凋亡研究和免疫学方面起着非常重要的作用。在流式细胞实验过程中，荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响着实验的数据质量。

 

          随着流式细胞术的日益发展，流式抗体及荧光标记产品的种类、数量也在不断增多，加上多色分析实验方案需求的增长，逐渐产生了抗体难选择、荧光难搭配等问题，如何选择合适的流式抗体，也成为了流式技术是否能成功的关键因素之一。

 

一、满足抗体具备的基本条件

确定所需检测的指标，目的细胞的特异性表面标记或胞内标记；

根据检测样本的种属选择抗体，流式抗体基本无法进行种属交叉反应；

根据抗体的说明，明确是否可以用于流式实验。

 

 

二、确定所使用仪器的参数配置

 

激光器：不同的流式细胞仪激光器不同，常见的有405nm，488nm和635nm，需要根据具体的仪器进行确定。

滤光片：检测通道的多少，决定最多可以同时检测几个指标。荧光素的发射波长与滤光片有关，所选择荧光素要在仪器的可检测范围内。

仪器：相同的荧光在不同的仪器上检测通道可能不同，需要参照仪器的说明。

 

 

三、荧光的选择

荧光有强弱之分，如抗原表达弱或分群不明显的建议选择强荧光，如PE、APC；反之，抗原表达强或分群明显的建议选择最常用的弱荧光例如FITC即可。常用荧光强弱排序程度为：PE>APC>PE-cy5Cy5>PercCPp-Cycy5.5>FITC

 

四、多色荧光搭配

很多实验需要同时检测几个指标，此时就需要多个荧光标记进行搭配。流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定的：流式细胞仪能检测多少个通道、需要同时检测检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记。

 

能检测多少通道是又激光决定的需要注意所使用的仪器有哪些激光。每个检测通道只能选择1种荧光素，各通道之间的荧光素可以随意搭配，检测通道不能冲突。

 

如果需要做多个指标，而流式细胞仪能检测的通道不够，首先将指标归成2类，再将样本分成2份，分别进行检测。

 

所选各种荧光素光谱的重叠应当尽量减少，否则将会导致较大的补偿。例如，PE-Ccy5与APC同时标记，将会导致补偿过度，需换成PE-Ccy5.5或PerCPcp-Ccy5.5。

 

 

五、同型对照抗体

同型对照，是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，类似于阴性对照，是流式细胞实验不可或缺的一项。

 

同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型及亚链、相同荧光标记的免疫球蛋白，也要求使用相同剂量。如一抗是抗human CD3-FITC(mouse IgG1)，同型对照则为Mouse IgG1-FITC.

 

如果是纯化的一抗加荧光标记的二抗，那么应该选择与一抗相对应的同型对照抗体，如纯化的CD3+PE标记的二抗，则对照为纯化的同型对照+ PE标记的二抗。

 

有时候同型对照的表达会比抗体的表达高，首先检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。其次，因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高，而跟其类似的抗原非常多，那么同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性，所以会造成这种现象。这个时候推荐使用其他阴性对照，如空白对照等。


         欢迎访问biorbyt全球官方网站（www.biorbyt.com）和中国网站（www.biorbyt.com.cn），或者拨打biorbyt中国办事处热线电话：400-966-3101；027-87663101。 或微信（电话）13871074302在线沟通。