标签蛋白大盘点_公司新闻

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标签蛋白大盘点

人阅读发布时间：2023-09-15 09:15

研究某个蛋白的功能的时候，我们期待能够定位它或研究蛋白相互作用。有一种方法就是将一个通过各种方法可以检测到的标签蛋白的基因，和目标蛋白的基因进行重组融合，基因表达后产生的融合蛋白除了目标蛋白本身，同时会带上可检测的标签蛋白，这样目标蛋白也被一并检测到了。

设计具有标签的蛋白质时需要考虑的因素：亲和力和可溶性的选择。

将高表达的内源性蛋白质融合在外源目标蛋白质的N端不仅是一个提高产量的方法,而且还可以增加目标蛋白质的可溶性，这是可溶性标签的基本原理。

另外,亲和标签对蛋白质的纯化也至关重要,它提供了多种策略使目标蛋白质结合在亲和基质上。

亲和标签和可溶性标签在分子质量上差别非常大,因此它们给宿主细胞带来的代谢负担也有很大不同。

常见的亲和标签

1.His标签

His标签是最简单、使用最广泛的蛋白标签，被认为是蛋白纯化的shou选标签。它是由六个组氨酸残基（HHHHHH）组成的融合标签，分子量极小只有~0.84KD，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析（IMAC），对重组蛋白进行分离纯化。

因为His-Tag非常小，不会改变目的蛋白自身的可溶性，而且融合蛋白结晶后对蛋白结构影响很小或完全没有。除此之外，His-Tag免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体。

2.GST标签

谷胱甘肤-S-转移酶(GST)是一种表达量很高的26KDa的真核蛋白质。GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在中性温和条件下用10mM还原型谷胱甘肽洗脱。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。

由于GST为高度可溶的蛋白，可以增加外源蛋白的可溶性；另外GST可在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。

3.表位标签

添加表位标签作为追踪重组蛋白的做法已被广泛运用，宿主细胞通常没有与表位标签相同的氨基酸序列，使得对靶蛋白的检测变得容易。但是纯化时，与表位标签结合的介质（通常是被固定在色谱层析树脂上的单抗）价格昂贵，不适合大规模的蛋白质制备。常见的表位标签如下：

Flag标签，是由八个氨基酸(DYKDDDDK )组成的亲水性短肽，专门设计用于重组蛋白质的免疫吸附纯化。是第一个为用于融合蛋白而设计的表位标签，并且是唯yi一个申请专利的标签。Flag标签结构短小，且与融合蛋白质之间含有一个肠激酶切割位点，可以通过肠激酶切割被除去。

HA标签蛋白标签序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，9个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小,容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti－HA抗体检测和ELISA检测。

HA融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。

C-Myc标签序列为EQKLISEEDL，它作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中可识别其相应的抗体。c-Myc标签应用于Western-blot杂交技术、免疫沉淀和细胞流式术中，可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。Myc标签蛋白本身即为人的Myc基因的一部分，所以在将该蛋白应用于人的细胞或组织相关的实验的时候，应尽量避免。

常见的可溶性标签

1.MBP

麦芽糖结合蛋白(MBP)能特异性地结合麦芽糖和直链淀粉，它不仅可作为一种可溶性标签，而且能够有效的亲和纯化。MBP是一个43kDa的大肠杆菌分泌型蛋白，它的表达水平很高，MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。

融合蛋白可通过交联淀粉亲和层进一步纯化，但不能在还原剂或变性环境中进行。如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。

2.SUMO

SUMO是一种小分子泛素样修饰蛋白，约11kDa，是泛素类多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上，SUMO与泛素只有18%的同源性，然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。研究发现SUMO蛋白不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。SUMO融合系统也已经通过改造用于昆虫和其他真核表达系统。

此外，SUMO还有一项重要的应用，就是可用于完整地切除标签蛋白，得到天然蛋白。因为SUMO蛋白水解酶能识别完整的SUMO标签蛋白序列，并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来。切除SUMO后，经过亲和层析，去除标签蛋白部分，就得到和天然蛋白一样的重组蛋白。所以SUMO标签也常用于和其他标签一起应用，作为特异酶切水解位点。

一些蛋白质标签既可作为亲和标签，又可作为可溶性标签。例如谷胱甘肤-S-转移酶(GST)可以提高某些蛋白质的可溶性，而可溶标签麦芽糖结合蛋白(MBP)也可用于目标蛋白质的亲和纯化。

蛋白标签需不需要考虑分子量大小呢？

理论上说蛋白标签越大，对蛋白质本身的功能影响越大，所以大分子标签一般只用于检测或蛋白纯化等。常见的分子量较小的标签有His-Tag、Flag-Tag、HA-Tag、Myc-Tag，这些标签只有几个氨基酸，有很多商品化的抗体，用这些Tag主要用来节省成本，也节约大家制备单抗所需的时间。而大分子的蛋白标签常见的有SUMO、GFP、GST等。

蛋白标签是在N端还是C端好？

标签既可以添加在靶蛋白的N 端也可以添加在 C端。在N端添加标签的一个优势是可以利用标签上的高效翻译起始位点。源于高表达蛋白质的可溶性标签,如MBP，添加在N端时可以更加有效地提高靶蛋白的可溶性。在N端添加标签的另一个优势是可以完全去除这些标签，因为大多数内切酶的切割位点在C端或靠近识别位点的C端。

何时选择串联标签？

目标蛋白质上能够连接多个标签,以便更好地进行蛋白质的纯化、表达及追踪。串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)标签最初用来进行两步纯化:第一步使用偶联有 IgG的小珠子进行纯化,随后将 Protein A标签切除;第二步使用外面包裹着钙调蛋白的小珠子进行纯化。使用串联标签后,能够在天然条件下对蛋白质进行检测和纯化，即使蛋白质的表达量极低。

可溶性标签，也能够与亲和标签(如组氨酸标签)串联起来用以有效地纯化融合蛋白。在预期蛋白质表达量较低时，或抗体特异性(如抗组氨酸标签的抗体)不能满足要求时，也能够加入其他标签用来检测目标蛋白质，如 FLAG 标签。亲和标签也能够连接在靶蛋白的两端。